我素，杨慎无可奈何，只得称病告假，辞官归里。武宗驾崩，因武宗无子，经张皇后及杨廷和商议，便迎立其堂弟、兴王朱厚熜继位，是为明世宗。世宗即位后，授杨慎为翰林院修撰、经筵讲官。
杨慎利用给世宗讲书的机会，经常联系当时实际情况教育世宗，如对已判死罪尚未诛杀的佞宦张锐、于经等人，由于大肆行贿，世宗破例赦免了他们的死罪。在经筵讲课时，便特地选出《尚书》里《金作赎刑》这一章，对世宗讲道：“圣人赎刑之制，用于小过者，冀民自新之意；若大奸元恶，无可赎之理。”世宗听后很不高兴，常常借故停止讲书。
杨慎因性格耿直，既失欢于皇帝，又结怨于权奸，虽胸怀壮志，力图报国，但其政治才能在当时是难以施展的。特别是在内阁“大礼议”的纷争中，突出表现出杨慎的“叛逆”风骨。当时世宗以“兄终弟及”的方式登基后，按照皇统继承规则，要承认孝宗是“皇考”，享祀太庙；自己的生父只能称“本生父”或“皇叔父”。世宗即位后第六天，就下诏令群臣议定他自己的生父兴献王为“皇考”按皇帝的尊号和祀礼对待；这样，皇统与家系就成了当时内阁大臣纷争的议题。
当时，张璁、桂萼等新贵为迎合上意，攀附权奸，主张在宪宗与武宗之间，加入兴献王朱佑杬，杨廷和父子和许多大臣坚决反对。为此，杨廷和辞官归里，杨慎一再上书辞职，不愿与张、桂等“无耻小人”同列共事。世宗大怒，正式下诏改称生父为恭穆皇帝，杨慎“又谐学士丰熙等疏谏。不得命，偕廷臣伏左顺门力谏”，世宗更加震怒，使用暴力镇压，“命执首八人下诏狱”。消息传出，群情激愤。杨慎约集同年进士检讨王元正等二百多人，激动地说：“国家养士一百五十年，仗节死义，正在今日。”于是，在金水桥、左顺门一带列宫大哭，抗议非法逮捕朝臣，声彻宫廷。世宗怒气不减，将他们全部逮入诏狱，加以廷杖，杨慎于七月十五被捕，十七日被廷杖一次，死而复苏，隔十日，再廷杖一次，几乎死去，然后充军云南永昌卫。
杨廷和在武宗驾崩、世宗未至时，曾总揽朝政共三十七日，他裁撤许多冒滥军功的官员。至杨慎被贬后，被裁撤的挟怨者招募了一些亡命之徒在路上埋伏，要伺机杀害杨慎。杨慎知道后，一路小心防备，到临清县