都察院、刑部平议一事被严嵩设计逐出御史台，并遭贬官二秩。
严嵩、严世藩父子罪行败露，严世藩下狱，严嵩致仕，赵大佑迁升南京刑部尚书。他在查办齐庶人可涧杀害家仆反诬富室子儒生陆某所为案件中，面对诸多官员畏势引嫌不敢断案，毅然独出法办治罪齐庶人，并释放陆某。在面对世宗至宠近侍宦官黄锦为属下马广犯死罪而请托，并行重贿于他时，严辞拒绝称“岂可以大霈释当诛之人”，奏请朝廷杀之，行弃市之刑。
在严格依律治事的同时，坚持治狱宽猛相济，曾道：“人命至重，王法至公。”看到刑狱“因循日久，往往断理不公，怨声满道”时，提出“务要虚心鞠审”“虚心推究、缘情求实”“禁止滥用酷刑”“疑罪从无”，对“轻罪或无干证的”予以释放等主张。是时，南京人称“执法不冤者，则一口以为赵尚书云”。
在刑部尚书任上进资德大夫，勋正治正卿，其祖、父皆进尚书，祖母暨母皆夫人，满载殊荣，门楣光耀。对此，赵大佑告诫子弟道：“门第高，可惧不可恃，以成立之难，而覆坠易之也。愿而曹惧之。”赵大佑祖上历来重视治家，严不废律，把“子姓受约束，勤生产，起财以义，敬重祖先”作为家训延续，强调“治家不富不贫，守己无荣无辱，先世咸考终命，后人永保贞吉”。淳厚、严谨的赵氏家风家训影响了赵大佑的一生。
在赵氏祖训中，最核心的是强调对子弟的教育，称“食可无少，衣可缺，读书不可失”，要做到“躬行惟师友，事业在诗书”，并反复勉励子弟刻苦学习，谨记“务学当有常，否则一暴十寒矣；用功当知要，否则泛而不切矣”，做到“隆师友，笃课程。朝夕鞭辟，讲明义礼，不使追逐时好”，并告诫子弟“饱食暖衣宜思自树”“人生未老而享既老之福，恐不得老；未贵而享既贵之福，终不能贵”。
赵大佑入仕前，在县学读书时曾因学田少而难供学费，夫人牟氏将所有陪嫁妆奁资助于他，自己过着“食不重味，衣布帛，无纨绮”的生活，日夜操劳，“由衣服饮食，由执事，毋敢倦勤”。赵大佑得夫人治家有方，潜心治学，终中举、进士、入仕。
此后，赵大佑虽长年在朝为官，与子弟少相聚，但始终牵挂对子弟的教育，在《喜得家书示儿》中指出：“寒暑资