左右了神宗，神宗下令查抄张居正的家。于慎行在这种情况下，不避嫌怨，写信给主持此事的丘橓，请他照顾张居正80多岁的老母和不成年的幼子，丘橓给张家保留了住宅和足够的土地。于慎行的高风亮节、古道热肠受到朝中一片赞誉，升任礼部尚书。
神宗的长子已经9岁，是王妃所出，神宗不喜欢王妃和她这个儿子，他想立郑妃所生的皇次子为东宫。但是，王妃名分在郑妃之前，神宗不好把这一想法明说，故而迟迟不立太子。满朝文武见皇长子日渐长大，不能正位进学，非常着急。自万历十七年起，不断有人提出立储问题，请神宗早建东宫，于慎行身为礼部尚书，对此事义不容辞。他连疏极谏，神宗非常生气，再三降下严旨，责备于慎行“以东宫要挟皇上。”于慎行说：“册立之事，是臣部职掌，我如果不说，是为失职。请皇上速决大计，我宁可弃官归里。”神宗很不高兴，大骂于慎行“疑上”、“淆乱国本”，把礼部大小官员都停了俸禄。正在这时，发生了山东乡试泄题事件，于慎行引咎辞职，获神宗批准，归隐故乡。
家居10余年，朝野上下多次荐他出山，神宗皆不允。东宫已立、国本确定，廷推内阁大臣，于慎行名列7人之首，神宗命他以原官加太子少保兼东阁大学士入阁办事。这时候，于慎行已经重病缠身，勉强到京进谒，不数日，卒于京华官邸，年63岁，赠太子太保，谥文定。